تفاوت کلیدی – ماکسام گیلبرت در مقابل توالی سانگر
نوکلئوتیدها واحدهای ساختاری اساسی و بلوک های سازنده DNA هستند. مولکول DNA از یک زنجیره پلی نوکلئوتیدی تشکیل شده است. چهار نوکلئوتید مختلف در DNA یافت می شود. این نوکلئوتیدها از چهار باز نیتروژنی مختلف به نام‌های A (آدنین)، G (گوانین)، C (سیتوزین)، T (تیمین) تشکیل شده‌اند. ترتیب نوکلئوتیدها در مولکول DNA از اهمیت زیادی برخوردار است زیرا اطلاعات ژنتیکی مهمی را برای رشد و نمو موجودات رمزگذاری می کند. توالی یابی DNA به فرآیندی اشاره دارد که توالی نوکلئوتیدی دقیق DNA را تعیین می کند. روش های مختلفی برای تعیین توالی DNA وجود دارد.توالی یابی ماکسام گیلبرت و توالی یابی DNA سانگر دو روش توالی یابی DNA هستند که به توالی یابی نسل اول تعلق دارند. روش توالی یابی Maxam Gilbert توالی پایه را با برش شیمیایی قطعات DNA نشاندار شده با انتهای 5' ترجیحاً در هر یک از چهار نوکلئوتید و الکتروفورز ژل تعیین می کند. روش توالی یابی سانگر، توالی نوکلئوتیدی را با سنتز DNA تک رشته ای با استفاده از DNA پلیمراز و دی اکسی نوکلئوتید و الکتروفورز ژل تعیین می کند. این تفاوت کلیدی بین Maxam Gilbert و Sanger Sequencing است.
توالی یابی Maxam Gilbert چیست؟
توالی یابی ماکسام گیلبرت که به عنوان روش توالی یابی شیمیایی نیز شناخته می شود، تکنیکی است که برای تعیین ترتیب نوکلئوتیدها در DNA ایجاد شده است. این روش توسط والتر گیلبرت و آلن ماکسام در سال 1976 معرفی شد و از آنجایی که می توان آن را مستقیماً با DNA خالص انجام داد رایج شد. روش Maxam Gilbert متعلق به نسل اول توالی یابی DNA است و اولین روش توالی یابی است که به طور گسترده توسط دانشمندان مورد استفاده قرار گرفت.
اصل اساسی این روش در محدود کردن قطعات DNA نشاندار شده انتهایی در بازهای خاص توسط مواد شیمیایی و شرایط خاص باز و جداسازی قطعات نشاندار شده با الکتروفورز همانطور که در شکل 01 نشان داده شده است. به اندازه آنها روی ژل. از آنجایی که قطعات نشاندار شده اند، توالی مولکول DNA به راحتی قابل استنباط است.
روش ماکسام گیلبرت از مواد شیمیایی خاص برای شکستن DNA در بازهای خاص استفاده می کند. دو ماده شیمیایی رایج به نام‌های دی متیل سولفات و هیدرازین به ترتیب برای حمله انتخابی به پورین‌ها و پیریمیدین‌ها استفاده می‌شوند.
روش توالی یابی ماکسام گیلبرت از طریق چندین مرحله به شرح زیر انجام می شود.
- تصفیه توالی DNA با استفاده از اندونوکلئازهای محدودکننده
- برچسب گذاری انتهای قطعات DNA با افزودن فسفات های رادیواکتیو
- تصفیه قطعات نشاندار شده از قطعات بدون برچسب با الکتروفورز ژل
- جداسازی DNA نشاندار انتهایی به چهار لوله و درمان با مواد شیمیایی خاص پایه به طور جداگانه
- الکتروفورز محتویات هر لوله در خطوط جداگانه روی ژل و جداسازی قطعات بر اساس طول آنها.
- تشخیص قطعات توسط اتورادیوگرافی.
شکل 01: ماکسام گیلبرت توالی
Sanger Sequencing چیست؟
Sanger Sequencing یک روش توالی یابی است که توسط فردریک سانگر و همکارانش در سال 1977 برای تعیین توالی پایه یک قطعه DNA معین ایجاد شد. همچنین به عنوان روش توالی یابی پایان زنجیره یا روش توالی یابی Dideoxy شناخته می شود. این روش بر اساس اصل ادغام انتخابی دی‌اکسی نوکلئوتیدهای پایان‌دهنده زنجیره (ddNTPs) مانند ddGTP، ddCTP، ddATP و ddTTP توسط DNA پلیمراز در طی سنتز DNA تک رشته‌ای برای پایان دادن به تشکیل رشته کار می‌کند.دیدئوکسی نوکلئوتیدها برای تشکیل پیوندهای فسفودی استری با نوکلئوتید مجاور، فاقد گروه های 3’ OH هستند. از این رو، تشکیل رشته زمانی متوقف می شود که یک ddNTP در طول توالی خوانی به رشته تازه تشکیل شده ادغام شود.
در این روش، چهار واکنش سنتز DNA (PCR) جداگانه در چهار لوله مجزا با یک نوع ddNTP انجام می شود. سایر الزامات نیز برای لوله‌های PCR شامل پرایمرها، dNTPs، Taq polymerase، شرایط خاص و غیره ارائه می‌شود. چهار واکنش جداگانه در چهار لوله با چهار مخلوط انجام می‌شود. پس از واکنش‌های PCR، قطعات DNA حاصل از حرارت دناتوره شده و با الکتروفورز ژل جدا می‌شوند. سپس قطعات با استفاده از یک پرایمر نشاندار (رادیواکتیو یا فلورسنت) یا dNTPs همانطور که در شکل 02 نشان داده شده است، مشاهده می شوند.
شکل 02: توالی سانگر
تفاوت بین Maxam Gilbert و Sanger Sequencing چیست؟
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| توالی یابی Maxam Gilbert اولین تکنیکی است که برای توالی یابی DNA توسعه یافته است. | روش توالی یابی سنگر پس از روش توالی یابی ماکسام گیلبرت معرفی شد. |
| استفاده | |
| این روش به ندرت استفاده می شود. | توالی سنجی سانجر به طور معمول برای توالی یابی استفاده می شود. |
| استفاده از مواد شیمیایی خطرناک | |
| از مواد شیمیایی خطرناک استفاده می کند. | استفاده از مواد شیمیایی خطرناک در مقایسه با روش Maxam Gilbert محدود است. |
| برچسب‌گذاری برای تشخیص | |
| این روش از رادیواکتیو P32 برای برچسب زدن انتهای قطعات DNA استفاده می کند. | توالی‌یابی سانجر از ddNTPهای دارای برچسب رادیواکتیو یا فلورسنت استفاده می‌کند. |
خلاصه - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
توالی یابی Maxam Gilbert و Sanger دو نوع تکنیک توالی یابی DNA هستند که تحت توالی یابی DNA نسل اول قرار می گیرند. توالی یابی Maxam Gilbert اولین روشی است که در سال 1976 برای تعیین توالی DNA معرفی شد و با شکستن قطعات DNA نشاندار شده انتهایی توسط مواد شیمیایی مخصوص پایه انجام می شود. از این رو، به عنوان توالی یابی شیمیایی شناخته می شود. روش توالی یابی سانگر در سال 1977 معرفی شد و بر اساس واکنش های خاتمه زنجیره ای مبتنی بر ddNTP است. روش توالی یابی سانگر به دلیل معایب متعدد روش ماکسام گیلبرت از جمله مصرف بیش از حد زمان، استفاده از مواد شیمیایی خطرناک و غیره، محبوبیت زیادی نسبت به روش ماکسام گیلبرت دارد.این تفاوت بین ماکسام گیلبرت و توالی سانگر است.
