تفاوت کلیدی – NGS vs Sanger Sequencing
توالی یابی نسل بعدی (NGS) و توالی یابی سانگر دو نوع تکنیک توالی یابی نوکلئوتیدی هستند که در طول زمان توسعه یافته اند. روش Sanger Sequencing برای سالیان متمادی به طور گسترده مورد استفاده قرار گرفت و NGS به دلیل مزایای آن اخیرا جایگزین آن شده است. تفاوت اصلی بین NGS و توالی سنجی سانگر در این است که NGS بر اساس اصل توالی یابی میلیون ها توالی به طور همزمان به روشی سریع از طریق یک سیستم توالی یابی کار می کند در حالی که توالی سانگر به دلیل ترکیب انتخابی دی اکسی نوکلئوتیدها توسط آنزیم DNA پلیمراز بر روی اصل خاتمه زنجیره کار می کند. در طول تکثیر DNA و جداسازی قطعات حاصل از الکتروفورز مویرگی.
توالی نوکلئوتیدی چیست؟
اطلاعات ژنتیکی در توالی های نوکلئوتیدی DNA یا RNA یک موجود زنده ذخیره می شود. فرآیند تعیین ترتیب صحیح نوکلئوتیدها (با استفاده از چهار باز) در یک قطعه معین (در یک ژن، خوشه ژن، کروموزوم و ژنوم کامل) به عنوان توالی نوکلئوتیدی شناخته می شود. در مطالعات ژنومی، مطالعات پزشکی قانونی، ویروس شناسی، سیستماتیک بیولوژیکی، تشخیص پزشکی، بیوتکنولوژی و در بسیاری از زمینه های دیگر تجزیه و تحلیل ساختار و عملکرد ژن ها بسیار مهم است. انواع مختلفی از روش های توالی یابی وجود دارد که توسط دانشمندان ایجاد شده است. در میان آنها، توالی سانگر که توسط فردریک سانگر در سال 1977 توسعه یافت، به طور گسترده ای مورد استفاده قرار گرفت و برای مدت طولانی رایج شد تا اینکه توالی نسل بعدی جایگزین آن شد.
NGS چیست؟
توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) اصطلاحی است که برای اشاره به فرآیندهای توالی‌یابی با توان بالا مدرن استفاده می‌شود. تعدادی از فن آوری های مختلف توالی یابی مدرن را توصیف می کند که مطالعات ژنومی و زیست شناسی مولکولی را متحول کرد.این تکنیک ها عبارتند از: توالی یابی Illumina، توالی یابی Roche 454، توالی یابی پروتون یونی و توالی یابی SOLID (توالی یابی با تشخیص بستن اولیگو). سیستم‌های NGS سریعتر و ارزان‌تر هستند. چهار روش اصلی تعیین توالی DNA در سیستم های NGS استفاده می شود. پیروزه یابی، توالی یابی با سنتز، توالی یابی با بستن و توالی یابی نیمه هادی یونی. تعداد زیادی از رشته های DNA یا RNA (میلیون ها) را می توان به صورت موازی توالی یابی کرد. بر خلاف توالی یابی سانگر که زمان بیشتری را می طلبد، امکان تعیین توالی کل ژنوم موجودات را در مدت زمان کوتاهی فراهم می کند.
NGS نسبت به روش سانگر توالی یابی معمولی مزایای زیادی دارد. این یک فرآیند با سرعت بالا، دقیق تر و مقرون به صرفه است که می تواند با حجم نمونه کوچک انجام شود. NGS را می توان در مطالعات متاژنومی، در تشخیص تغییرات درون ژنوم فردی به دلیل درج و حذف و غیره و در تجزیه و تحلیل بیان ژن استفاده کرد.
شکل_1: تحولات در توالی NGS
Sanger Sequencing چیست؟
Sanger Sequencing یک روش توالی یابی است که توسط فردریک سانگر و همکارانش در سال 1977 برای تعیین ترتیب دقیق نوکلئوتیدی یک قطعه DNA معین ایجاد شد. همچنین به عنوان توالی پایان زنجیره یا توالی یابی Dideoxy شناخته می شود. اصل کار این روش خاتمه سنتز رشته با ادغام انتخابی یک زنجیره پایان دهنده دی اکسی نوکلئوتیدها (ddNTPs) مانند ddGTP، ddCTP، ddATP و ddTTP توسط DNA پلیمراز در طول تکثیر DNA است. نوکلئوتیدهای معمولی دارای گروه های OH 3 برای تشکیل پیوند فسفودی استری بین نوکلئوتیدهای مجاور برای ادامه تشکیل رشته هستند. با این حال، ddNTP ها فاقد این گروه OH 3 هستند و قادر به ایجاد پیوندهای فسفودی استری بین نوکلئوتیدها نیستند. بنابراین، ازدیاد طول زنجیره متوقف می شود.
در این روش، DNA تک رشته ای که باید توالی یابی شود، به عنوان رشته الگو برای سنتز DNA در شرایط آزمایشگاهی عمل می کند.سایر الزامات پرایمر اولیگونوکلئوتید، پیش سازهای دئوکسی نوکلئوتید و آنزیم DNA پلیمراز است. هنگامی که انتهای طرفین قطعه هدف مشخص باشد، پرایمرها را می توان به راحتی برای همانندسازی DNA طراحی کرد. چهار واکنش سنتز DNA مجزا در چهار لوله مجزا انجام می شود. هر لوله دارای ddNTP های جداگانه، همراه با سایر الزامات است. از نوکلئوتید خاص، مخلوطی از dNTP و ddNTP اضافه می شود. به همین ترتیب، چهار واکنش جداگانه در چهار لوله با چهار مخلوط انجام می شود. پس از انجام واکنش ها، تشخیص قطعات DNA و تبدیل الگوی قطعه به اطلاعات توالی انجام می شود. قطعات DNA حاصل از حرارت دناتوره شده و با الکتروفورز ژل جدا می شوند. اگر از نوکلئوتیدهای رادیواکتیو استفاده شود، الگوی نواری در ژل پلی آکریل آمید را می توان با اتورادیوگرافی مشاهده کرد. هنگامی که این روش از دی اکسی نوکلئوتیدهای برچسب گذاری شده با فلورسنت استفاده می کند، می توان آن را در ژل خوانده شده کاهش داد و از طریق یک پرتو لیزر عبور داد تا توسط آشکارساز فلورسنت شناسایی شود.برای جلوگیری از خطاهایی که ممکن است هنگام خواندن یک دنباله با چشم و وارد کردن دستی به رایانه ایجاد شود، این روش به استفاده از ترتیب‌دهنده خودکار همراه با رایانه توسعه یافت.
این روشی است که برای تعیین توالی DNA از پروژه ژنوم انسان استفاده می شود. این روش هنوز با اصلاحات پیشرفته مورد استفاده قرار می گیرد زیرا با وجود اینکه یک فرآیند گران و کند است، اطلاعات توالی دقیقی را ارائه می دهد.
شکل_2: توالی سانگر
تفاوت بین NGS و Sanger Sequencing چیست؟
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) به فرآیندهای توالی‌یابی با توان بالا مدرن اشاره دارد. تعدادی از فن آوری های مختلف توالی یابی مدرن را توصیف می کند | Sanger Sequencing یک روش توالی یابی است که توسط فردریک سانگر برای تعیین ترتیب دقیق نوکلئوتیدی یک قطعه DNA معین ایجاد شده است. |
| کارآمدی هزینه | |
| NGS فرآیند ارزان‌تری است زیرا زمان، نیروی انسانی و مواد شیمیایی را کاهش می‌دهد. | این یک فرآیند پرهزینه است زیرا زمان، نیروی انسانی و مواد شیمیایی بیشتری را می طلبد. |
| سرعت | |
| این سریعتر است زیرا هم تشخیص شیمیایی و هم تشخیص سیگنال بسیاری از رشته ها به صورت موازی انجام می شود. | این زمان‌بر است زیرا تشخیص شیمیایی و تشخیص سیگنال به‌عنوان دو فرآیند مجزا اتفاق می‌افتد و فقط در رشته می‌توانند در یک زمان بخوانند. |
| قابلیت اطمینان | |
| NGS قابل اعتماد است. | توالی سانجر کمتر قابل اعتماد است |
| اندازه نمونه | |
| NGS به مقدار کمتری DNA نیاز دارد. | این روش به مقدار زیادی DNA الگو نیاز دارد. |
| پایه های DNA در هر قطعه توالی شده | |
| تعداد بازهای DNA در هر قطعه توالی‌یابی شده کمتر از روش سانگر است | تولید توالی‌ها طولانی‌تر از دنباله‌های NGS هستند. |
خلاصه - NGS vs Sanger Sequencing
NGS و Sanger Sequencing تکنیک های توالی یابی نوکلئوتیدی هستند که به طور گسترده در زیست شناسی مولکولی استفاده می شود. توالی یابی سانگر یک روش توالی یابی اولیه است که با NGS جایگزین شد. تفاوت اصلی بین NGS و Sanger Sequencing این است که NGS فرآیندی با سرعت بالا، دقیق تر و مقرون به صرفه تر از توالی سنجی Sanger است.هر دو روش شیوع گسترده ای در ژنتیک و بیوتکنولوژی ایجاد کردند.
