تفاوت کلیدی - PCR در مقابل توالی‌یابی DNA
PCR و تعیین توالی DNA دو تکنیک مهم در زیست شناسی مولکولی هستند. واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) فرآیندی است که تعداد زیادی کپی از یک قطعه DNA ایجاد می کند. توالی یابی DNA تکنیکی است که به ترتیب دقیق نوکلئوتیدهای یک قطعه DNA مشخص می شود. این تفاوت کلیدی بین PCR و تعیین توالی DNA است. PCR یکی از مراحل اصلی در تعیین توالی DNA است.
PCR چیست؟
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک تقویت DNA است که در زیست شناسی مولکولی استفاده می شود. هزاران تا میلیون ها کپی از یک قطعه DNA خاص تولید می کند.این روش توسط Kary Mullis در سال 1983 توسعه یافت. در این روش، قطعه DNA برای تکثیر به عنوان الگو عمل می کند و آنزیم DNA پلیمراز نوکلئوتیدهای مکمل را به پرایمری که در مخلوط PCR موجود است اضافه می کند. در پایان واکنش PCR، نسخه‌های زیادی از DNA نمونه ساخته می‌شود.
اجزای مختلفی در مخلوط PCR وجود دارد، از جمله DNA، DNA پلیمراز (Taq polymerase)، پرایمرها (پرایمرهای رو به جلو و معکوس)، نوکلئوتیدها (بلوک های سازنده DNA) و یک بافر. PCR در داخل دستگاه PCR اتفاق می افتد و مخلوط صحیح PCR باید در دستگاه بارگذاری شود و برنامه صحیح باید اجرا شود. این تکنیک امکان تولید هزاران تا میلیون‌ها نسخه از یک بخش خاص از DNA را از مقدار بسیار کمی DNA فراهم می‌کند.
واکنش های PCR به روش حلقوی برای تولید مقدار قابل مشاهده محصولات PCR روی ژل رخ می دهد. سه مرحله اصلی در واکنش PCR وجود دارد که عبارتند از دناتوراسیون، بازپخت پرایمر و گسترش رشته همانطور که در شکل 01 نشان داده شده است.این سه مرحله در سه دمای مختلف اتفاق می‌افتند. DNA به شکل دو رشته ای توسط پیوندهای هیدروژنی بین بازهای مکمل وجود دارد. قبل از مفهوم، DNA دو رشته ای باید از یکدیگر جدا شوند. با دادن دمای بالا انجام می شود. در دمای بالا، DNA دو رشته ای به تک رشته ها دناتوره می شود. سپس پرایمرها باید به انتهای طرفین قطعه خاص یا ژن DNA نزدیک شوند. پرایمر قطعه کوتاهی از DNA تک رشته ای است که مکمل توالی هدف است. پرایمرهای رو به جلو و معکوس با پایه های مکمل در انتهای کناری DNA نمونه دناتوره شده در دمای بازپخت بازپخت می شوند. پرایمرها باید در برابر حرارت مقاوم باشند. هنگامی که پرایمرها با DNA نمونه بازپخت شدند، آنزیم taq polymerase با افزودن نوکلئوتیدهایی که مکمل DNA هدف هستند، سنتز رشته های جدید را آغاز می کند. Taq polymerase یک آنزیم پایدار در برابر حرارت است که از یک باکتری گرمادوست به نام Thermus aquaticus جدا شده است. بافر PCR شرایط بهینه را برای عمل taq polymerase حفظ می کند.این سه مرحله از واکنش های PCR برای تولید مقدار مورد نیاز محصول PCR تکرار می شوند. پس از هر واکنش PCR، تعداد کپی DNA دو برابر می شود. از این رو، یک تقویت نمایی را می توان در PCR مشاهده کرد. محصولات PCR را می توان با استفاده از الکتروفورز ژل مشاهده کرد و برای مطالعات بیشتر می توان آنها را خالص کرد.
شکل 01: مراحل اصلی یک واکنش PCR
PCR یک ابزار ارزشمند در تحقیقات پزشکی و بیولوژیکی است. PCR در علم پزشکی قانونی ارزش ویژه ای دارد زیرا می تواند DNA را برای مطالعات نمونه های کوچک مجرمان تقویت کند و پروفایل های DNA پزشکی قانونی ایجاد کند. PCR به طور گسترده در بسیاری از زمینه های زیست شناسی مولکولی از جمله، ژنوتیپ، شبیه سازی ژن، تشخیص جهش، تعیین توالی DNA، ریزآرایه DNA و آزمایش پدری و غیره استفاده می شود.
شکل 02: واکنش زنجیره ای پلیمراز
توالی‌یابی DNA چیست؟
توالی یابی DNA عبارت است از تعیین ترتیب دقیق نوکلئوتیدها - آدنین، گوانین، سیتوزین و تیمین در یک قطعه DNA معین. اطلاعات ژنتیکی با استفاده از ترتیب صحیح نوکلئوتیدها در توالی های DNA ذخیره می شود. از این رو، یافتن ترتیب دقیق نوکلئوتیدها در یک قطعه DNA برای دانستن ساختار و عملکرد ژن ها بسیار مهم است.
پروتکلتوالی یابی DNA شامل فرآیندهای مختلفی است. اولین مرحله جداسازی DNA یا DNA ژنومی یک موجود زنده است. با استفاده از PCR (همانطور که در بالا توضیح داده شد)، ناحیه مورد نظر DNA باید تکثیر شود. محصول PCR تقویت شده باید با الکتروفورز ژل جدا شده و خالص شود. قطعات تقویت شده به عنوان الگوهایی برای توالی یابی ارائه می شوند.توالی یابی را می توان به دنبال توالی یابی سانگر یا روش توالی یابی با توان بالا انجام داد. تعیین توالی سانگر به الکتروفورز مویرگی قطعات DNA حاصل نیاز دارد. تعیین ترتیب صحیح نوکلئوتید را می توان با خواندن دستی اتورادیوگرافی ها یا با استفاده از توالی سنجی DNA خودکار انجام داد.
توالی‌یابی ژن به پروژه ژنوم انسان کمک کرد و نقشه‌برداری از ژنوم انسان را در سال 2003 تسهیل کرد. در پزشکی قانونی، توالی‌یابی DNA شناسایی افرادی را که توالی‌های DNA منحصربه‌فردی را نشان می‌دهند و مجرمان را شناسایی می‌کنند، امکان‌پذیر کرد. در پزشکی، توالی‌یابی DNA می‌تواند برای شناسایی ژن‌های مسئول بیماری‌های ژنتیکی و سایر بیماری‌ها، یافتن ژن‌های نقص و جایگزینی آنها با ژن‌های صحیح استفاده شود. در کشاورزی، از اطلاعات توالی‌یابی DNA برخی میکروارگانیسم‌ها برای تولید محصولات تراریخته با ویژگی‌های مطلوب اقتصادی استفاده می‌شود.
شکل 03: تعیین توالی DNA
تفاوت بین PCR و DNA Sequencing چیست؟
PCR در مقابل توالی‌یابی DNA |
|
| فرآیند PCR هزاران تا میلیون ها نسخه از قطعه DNA مورد نظر را ایجاد می کند. | توالی‌یابی DNA فرآیند تعیین ترتیب دقیق نوکلئوتیدها در یک قطعه DNA معین است. |
| نتیجه | |
| PCR هزاران تا میلیون ها کپی از یک قطعه DNA خاص ایجاد می کند | این منجر به ترتیب صحیح بازها در یک قطعه DNA خاص می شود. |
| مشارکت ddNTPs | |
| PCR به ddNTP نیاز ندارد. از dNTP ها استفاده می کند. | توالی‌یابی DNA به ddNTPs برای پایان دادن به تشکیل رشته نیاز دارد. |
خلاصه - PCR در مقابل توالی‌یابی DNA
PCR و توالی یابی DNA ابزارهای بسیار مهمی در بسیاری از زمینه های زیست شناسی مولکولی هستند. تکثیر قطعات DNA با تکنیک PCR انجام می شود در حالی که ترتیب صحیح نوکلئوتیدهای یک قطعه DNA با توالی یابی DNA تعیین می شود. این تفاوت بین PCR و تعیین توالی DNA است.
