تفاوت کلیدی – RT PCR در مقابل QPCR
واکنش زنجیره ای پلیمراز تکنیکی است که برای تکثیر ناحیه خاصی از DNA در شرایط آزمایشگاهی استفاده می شود. با توجه به اختراع این تکنیک توسط Kary Mullis در سال 1983، دانشمندان قادر به ساخت هزاران تا میلیون ها نسخه از قطعات خاص DNA برای اهداف تحقیقاتی هستند. در حال حاضر این روش به یک تکنیک رایج و معمول در آزمایشگاه‌های بالینی و تحقیقاتی برای کاربردهای مختلف تبدیل شده است. انواع روش های سنتی PCR مانند RT PCR، Nested PCR، Multiplex PCR، Q PCR، RT – QPCR و غیره وجود دارد. RT PCR و Q PCR دو نوع مهم PCR هستند. تفاوت اصلی بین RT PCR و Q PCR در این است که RT PCR برای تشخیص بیان ژن از طریق ایجاد رونوشت های DNA مکمل (cDNA) از RNA استفاده می شود در حالی که Q PCR برای اندازه گیری کمی محصولات PCR در زمان واقعی با استفاده از رنگ های فلورسنت استفاده می شود.
RT PCR چیست؟
واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT PCR) گونه ای از PCR است که برای تشخیص بیان RNA استفاده می شود. این یک روش بسیار مهم برای تشخیص بیان mRNA در بافت ها است. RT PCR زمانی استفاده می شود که ماده اولیه نمونه RNA باشد. در RT PCR ابتدا mRNA الگو به DNA مکمل تبدیل می شود. این مرحله توسط آنزیم ترانس کریپتاز معکوس کاتالیز می شود و این فرآیند به عنوان رونویسی معکوس شناخته می شود. در مرحله دوم، PCR سنتی برای cDNA جدید سنتز شده برای تقویت استفاده می شود.
RT PCR یک تکنیک بسیار حساس است که به مقدار نسبتاً کمی نمونه RNA نیاز دارد. RT PCR معمولاً در تشخیص و تعیین کمیت گونه‌های RNA، به‌ویژه ویروس‌های RNA مانند ویروس نقص ایمنی انسانی و ویروس هپاتیت C استفاده می‌شود.
شکل 01: تکنیک RT PCR
QPCR چیست؟
Quantitative PCR (QPCR) گونه ای از PCR است که برای اندازه گیری کمی محصولات PCR استفاده می شود. همچنین از آن به عنوان واکنش زنجیره ای پلیمراز بلادرنگ یاد می شود زیرا تقویت زمان واقعی را با استفاده از دستگاه Real Time PCR اندازه گیری می کند. این یک روش مناسب برای تعیین مقدار یک توالی هدف یا ژن موجود در یک نمونه است. ویژگی جالب QPCR این است که هم تقویت و هم کمی سازی واقعی را در یک مرحله واحد ترکیب می کند. بنابراین نیاز به الکتروفورز ژل در تشخیص را می توان با تکنیک QPCR برطرف کرد. QPCR از رنگ های فلورسنت برای برچسب زدن محصولات PCR در طول واکنش های PCR استفاده می کند که در نهایت منجر به کمی سازی مستقیم می شود. هنگامی که محصولات PCR جمع می شوند، سیگنال های فلورسنت نیز جمع می شوند و توسط ماشین زمان واقعی اندازه گیری می شود. QPCR را می توان با RT PCR ترکیب کرد. این روش با نام های RT – QPCR یا QRT – PCR شناخته می شود و به عنوان قوی ترین، حساس ترین و کمی ترین روش برای تشخیص سطوح RNA در سلول ها یا بافت ها در نظر گرفته می شود.
SYBR گرین و Taqman دو روشی هستند که برای شناسایی یا تماشای فرآیند تقویت PCR زمان واقعی استفاده می شوند. روش SYBR Green با استفاده از رنگ فلورسنت به نام SYBR green انجام می شود و با اتصال رنگ برای تولید DNA دو رشته ای، تقویت را تشخیص می دهد. Taqman با استفاده از پروب های دارای برچسب دوگانه انجام می شود و تقویت را با تجزیه پروب توسط Taq پلیمراز و آزاد شدن فلوروفور همانطور که در شکل 02 نشان داده شده است، تشخیص می دهد. هر دو روش پیشرفت فرآیند تقویت را نظارت می کنند و مقدار محصول را در زمان واقعی گزارش می کنند.
Real Time PCR کاربردهای گسترده ای مانند کمی سازی بیان ژن، تجزیه و تحلیل microRNA و RNA غیر کدکننده، ژنوتیپ SNP، تشخیص واریانت های شماره کپی، تشخیص جهش های نادر، تشخیص ارگانیسم های اصلاح شده ژنتیکی، تشخیص عوامل عفونی دارد. و غیره
شکل 02: روش کمی PCR
تفاوت بین RT PCR و QPCR چیست؟
RT PCR در مقابل QPCR |
|
| RT PCR تکنیکی است که برای تشخیص بیان ژن از طریق تقویت استفاده می شود. | QPCR تکنیکی است که DNA را تقویت می کند و محصولات PCR را در زمان واقعی تعیین می کند. |
| درگیری آنزیم ترانس کریپتاز معکوس | |
| آنزیم ترانس کریپتاز معکوس برای RT PCR استفاده می شود. | آنزیم ترانس کریپتاز معکوس برای QPCR استفاده نمی شود. |
| استفاده از مولکول های دارای برچسب فلورسنت | |
| رنگ‌ها یا پروب‌های دارای برچسب فلورسنت برای RT PCR استفاده نمی‌شوند. | رنگ‌ها یا پروب‌های دارای برچسب فلورسنت برای QPCR استفاده می‌شوند. |
| تعیین کمیت محصول PCR | |
| مگر اینکه با QPCR همراه شود، RT PCR محصول PCR را کمیت نمی کند. | QPCR محصول PCR را به صورت کمی اندازه گیری کنید. |
| مواد شروع | |
| ماده شروع mRNA است. | ماده شروع DNA است. |
| سنتز cDNA | |
| DNA مکمل در طی RT PCR تولید می شود. | DNA مکمل در طول QPCR تولید نمی شود. |
خلاصه - RT PCR در مقابل QPCR
RT PCR و QPCR دو نسخه از PCR سنتی هستند. تکنیک RT PCR برای نمونه‌های mRNA انجام می‌شود و با رونویسی معکوس و تولید cDNA هدایت می‌شود. QPCR برای تعیین کمیت محصولات PCR در طول چرخه های حرارتی PCR زمان واقعی با استفاده از رنگ های فلورسنت یا پروب های برچسب دار استفاده می شود. در QPCR، مقدار محصول PCR توسط سیگنال های فلورسنت ساطع شده توسط نمونه نشان داده می شود. RT PCR معمولاً به عنوان یک فرآیند تقویت استفاده می شود در حالی که QPCR معمولاً به عنوان یک فرآیند کمی استفاده می شود. این تفاوت بین RT PCR و QPCR است.
