تفاوت اصلی بین سنجش PCR معمولی تو در تو و زمان واقعی در این است که PCR معمولی تکنیکی است که برای تقویت توالی های خاصی از DNA ایجاد شده است و PCR تودرتو اصلاحیه PCR معمولی است که از دو واکنش تقویت متوالی تشکیل شده است، در حالی که واقعی است. -time PCR نوعی از PCR معمولی است که قادر به تعیین کمیت محصول تقویت شده است.
PCR یک تکنیک علمی بسیار رایج است که به طور گسترده در تحقیقات و پزشکی برای تشخیص DNA استفاده می شود. آزمایشات PCR برای شناسایی آنتی ژن ها با تشخیص DNA یا RNA آنها استفاده می شود. به طور کلی، RNA ویروسی قبل از شناسایی آنتی بادی ها یا نشان دادن علائم بیماری در بدن وجود دارد.آزمایش PCR می تواند تشخیص دهد که آیا فردی در مراحل اولیه به ویروس مبتلا شده است یا خیر. در حال حاضر، PCR تست استاندارد برای تشخیص بیماری COVID-19 است. انواع مختلفی از تکنیک های PCR وجود دارد مانند Real-time PCR، Nested PCR، Multiplex PCR، hot start PCR و PCR برد بلند و غیره.
سنجش PCR معمولی چیست؟
سنجش PCR معمولی یک تکنیک تکثیر DNA در شرایط آزمایشگاهی است که به طور معمول در آزمایشگاه‌های بیولوژیکی مولکولی انجام می‌شود. این روش امکان تولید هزاران تا میلیون ها نسخه از یک قطعه DNA خاص را فراهم کرد. Kary Mullis این تکنیک را در سال 1980 معرفی کرد. این تکنیک به یک قطعه DNA معروف به الگو نیاز دارد تا بتواند کپی های زیادی از آن بسازد. Taq پلیمراز به عنوان آنزیم DNA پلیمراز عمل می کند و سنتز رشته های جدید توالی الگو را کاتالیز می کند.
پرایمرها در مخلوط PCR به عنوان نقطه شروع برای پسوند قطعه کار خواهند کرد. تمام مواد لازم برای تهیه کپی از DNA در مخلوط PCR گنجانده شده است.واکنش PCR در دستگاه PCR اجرا می شود و باید با مخلوط PCR صحیح و برنامه PCR صحیح تغذیه شود. اگر مخلوط واکنش و برنامه درست باشد، تعداد مورد نیاز از یک بخش خاص از DNA را از مقدار بسیار کمی DNA تولید می کند.
شکل 01: روش PCR معمولی
سه مرحله اصلی در واکنش PCR وجود دارد: دناتوراسیون، بازپخت پرایمر، و گسترش رشته. این سه مرحله در سه دمای مختلف رخ می دهد. بافر PCR شرایط بهینه را برای عمل Taq polymerase حفظ می کند. این سه مرحله از واکنش PCR برای تولید مقدار مورد نیاز محصول PCR تکرار می شود. در هر واکنش PCR، تعداد کپی های DNA دو برابر می شود.از این رو، تقویت نمایی را می توان در PCR مشاهده کرد. محصول PCR را می توان با استفاده از الکتروفورز ژل حل کرد زیرا مقدار قابل مشاهده ای از DNA روی ژل تولید می کند و می توان آن را برای مطالعات بیشتر مانند تعیین توالی خالص کرد.
PCR یک ابزار ارزشمند در تحقیقات پزشکی و بیولوژیکی است. به خصوص در مطالعات پزشکی قانونی، PCR ارزش بسیار زیادی دارد زیرا می تواند DNA را برای مطالعات نمونه های کوچک مجرمان تقویت کند و پروفایل های DNA پزشکی قانونی را ایجاد کند. PCR به طور گسترده در بسیاری از زمینه‌های زیست‌شناسی مولکولی از جمله، ژنوتیپ، شبیه‌سازی ژن، تشخیص جهش، تعیین توالی DNA، ریزآرایه‌های DNA و آزمایش پدری استفاده می‌شود.
سنجش‌های Nested PCR چیست؟
Nested PCR نوعی PCR است که تکثیر غیر اختصاصی DNA را کاهش می دهد. دو PCR متوالی یا دو واکنش تقویت متوالی در روش PCR تو در تو وجود دارد. در طی اولین واکنش تقویت، یک محصول PCR تولید می شود. پس از اولین واکنش، واکنش تقویت دوم بر روی محصول PCR واکنش اول انجام می شود.بنابراین، پرایمرهای مخلوط واکنش دوم با اولین محصول PCR متصل شده و آن را تقویت می کنند.
شکل 02: Nested PCR
جفت پرایمر در هر واکنش متفاوت است. اتصال غیر اختصاصی پرایمرها در Nested PCR کاهش می یابد. سنجش‌های Nested PCR برای افزایش حساسیت و/یا ویژگی مفید هستند. با این حال، PCR تودرتو به دانش در مورد توالی علاقه مند نیاز دارد.
سنجش زمان واقعی PCR چیست؟
Real-time PCR یا کمی PCR (Q PCR) نسخه اصلاح شده PCR است که محصولات PCR را به صورت کمی اندازه گیری می کند. بنابراین، این تکنیک تقویت را در زمان واقعی با استفاده از یک دستگاه PCR زمان واقعی تعیین می کند. همچنین روش مناسبی برای تعیین مقدار توالی هدف یا ژن موجود در نمونه است.
ویژگی جالب PCR بلادرنگ این است که هم تقویت و هم کمیت واقعی را در یک مرحله واحد ترکیب می کند. بنابراین، نیاز به الکتروفورز ژل برای تشخیص را می توان با تکنیک Real-time PCR حذف کرد. استفاده از رنگ های فلورسنت برای برچسب زدن محصولات PCR در طی واکنش های PCR در نهایت منجر به کمی سازی مستقیم می شود. هنگامی که محصولات PCR انباشته می شوند، سیگنال های فلورسنت نیز جمع می شوند و توسط دستگاه بلادرنگ اندازه گیری می شوند. SYBR Green و Taqman دو روش برای تشخیص یا تماشای فرآیند تقویت PCR بلادرنگ هستند. هر دو روش پیشرفت فرآیند تقویت را نظارت می کنند و مقدار محصول را در زمان واقعی گزارش می دهند.
شکل 03: PCR بلادرنگ
Real-time PCR دارای کاربردهای بسیار متنوعی مانند تعیین کمیت بیان ژن، تجزیه و تحلیل microRNA و RNA غیر کدکننده، ژنوتیپ SNP، تشخیص انواع تعداد کپی، تشخیص جهش های نادر، تشخیص ارگانیسم های اصلاح شده ژنتیکی، و تشخیص عوامل عفونی.
شباهت‌های بین سنجش PCR معمولی تودرتو و زمان واقعی چیست؟
- آزمون‌های PCR تودرتو و بلادرنگ اصلاحاتی در روش PCR معمولی هستند.
- هر سه تکنیک نمونه‌های DNA را تکثیر می‌کنند.
- محصولات آنها را می توان در توالی یا تجزیه و تحلیل استفاده کرد.
- این سنجش ها نیاز به پرایمر دارند.
تفاوت بین سنجش PCR معمولی تودرتو و زمان واقعی چیست؟
PCR معمولی تکنیکی است که برای تکثیر توالی های خاصی از DNA توسعه یافته است. در همین حال، Nested PCR اصلاحی از PCR معمولی است که از دو واکنش تقویت متوالی تشکیل شده است، و PCR زمان واقعی یک نوع PCR معمولی است که قادر به تعیین کمیت محصول تقویت شده است.بنابراین، این تفاوت کلیدی بین سنجش PCR معمولی تو در تو و زمان واقعی است. برخلاف PCR معمولی و بلادرنگ، PCR تودرتو از دو مجموعه پرایمر استفاده می کند. علاوه بر این، دو واکنش تقویت متوالی در Nested PCR به منظور کاهش تقویت غیر اختصاصی وجود دارد. علاوه بر این، سنجش PCR معمولی و بلادرنگ حاوی دو واکنش تقویت متوالی نیست.
اینفوگرافیک زیر تفاوت‌های بین سنجش PCR معمولی تو در تو و زمان واقعی را به شکل جدولی برای مقایسه کنار هم فهرست می‌کند.
خلاصه - سنجش‌های PCR معمولی در مقابل تودرتو در برابر زمان واقعی
PCR معمولی اولین تکنیک توسعه یافته برای تکثیر قطعات خاصی از DNA است. Nested PCR و Real-time PCR دو نوع PCR معمولی هستند. دو واکنش تقویت متوالی و استفاده از دو مجموعه پرایمر در Nested PCR وجود دارد. Real-time PCR برای تعیین کمیت محصول PCR تقویت شده توسعه یافته است. بنابراین، این تفاوت بین سنجش PCR معمولی تو در تو و زمان واقعی را خلاصه می کند.
