تفاوت کلیدی – توالی سانگر در مقابل پیروسکانسینگ
تعیین توالی DNA برای تجزیه و تحلیل DNA بسیار مهم است زیرا دانش آرایش صحیح نوکلئوتیدها در یک ناحیه DNA خاص اطلاعات مهم زیادی را در مورد آن نشان می دهد. روش های مختلفی برای تعیین توالی DNA وجود دارد. توالی یابی Sanger و Pyrosequencing دو روش مختلف توالی یابی DNA هستند که به طور گسترده در زیست شناسی مولکولی مورد استفاده قرار می گیرند. تفاوت اصلی بین توالی یابی Sanger و Pyrosequencing در این است که توالی یابی سانگر از دی اکسی نوکلئوتیدها برای پایان دادن به سنتز DNA برای خواندن توالی نوکلئوتیدی استفاده می کند در حالی که پیروسکانسینگ با ترکیب نوکلئوتیدها و سنتز ترتیب تکمیلی دقیق توالی برای خواندن، انتشار پیروفسفات را تشخیص می دهد.
Sanger Sequencing چیست؟
توالی یابی سانگر یک روش توالی یابی DNA نسل اول است که توسط فردریک سانگر و کالج هایش در سال 1977 توسعه یافت. همچنین به عنوان توالی یابی خاتمه زنجیره ای یا توالی یابی دیدئوکسی شناخته می شود زیرا بر پایه پایان دادن به زنجیره توسط دیداکسی نوکلئوتیدها (ddNTPs) است. این روش به طور گسترده برای بیش از 30 سال مورد استفاده قرار گرفت تا اینکه توالی یابی نسل جدید (NGS) توسعه یافت. تکنیک توالی یابی سانگر، کشف نظم نوکلئوتیدی صحیح یا اتصال یک قطعه DNA خاص را امکان پذیر کرد. این مبتنی بر ترکیب انتخابی ddNTPs و خاتمه سنتز DNA در طی تکثیر DNA در شرایط آزمایشگاهی است. عدم وجود گروه های OH 3 برای ادامه تشکیل پیوند فسفودیستر بین نوکلئوتیدهای مجاور، ویژگی منحصر به فرد ddNTPs است. بنابراین، هنگامی که ddNTP متصل می شود، ازدیاد طول زنجیره متوقف می شود و از آن نقطه خاتمه می یابد. چهار ddNTP وجود دارد - ddATP، ddCTP، ddGTP و ddTTP - در توالی سنجی Sanger استفاده می شود. این نوکلئوتیدها هنگامی که در رشته در حال رشد DNA گنجانده می شوند، فرآیند تکثیر DNA را متوقف می کنند و منجر به طول های مختلف DNA کوتاه می شوند.الکتروفورز ژل مویرگی برای سازماندهی این رشته های DNA کوتاه بر اساس اندازه آنها بر روی یک ژل همانطور که در شکل 01 نشان داده شده است استفاده می شود.
شکل 1: الکتروفورز ژل مویرگی DNA کوتاه سنتز شده
برای همانندسازی آزمایشگاهی DNA، نیازهای کمی باید ارائه شود. آنها آنزیم DNA پلیمراز، DNA الگو، آغازگرهای الیگونوکلئوتید و دئوکسی نوکلئوتیدها (dNTPs) هستند. در توالی یابی سنگر، همانندسازی DNA در چهار لوله آزمایش مجزا به همراه چهار نوع ddNTP به طور جداگانه انجام می شود. دئوکسی نوکلئوتیدها به طور کامل با ddNTP های مربوطه جایگزین نمی شوند. مخلوطی از dNTP خاص (به عنوان مثال، dATP + ddATP) در لوله گنجانده شده و تکرار می شود. چهار محصول لوله مجزا بر روی یک ژل در چهار چاه مجزا اجرا می شود. سپس با خواندن ژل می توان دنباله را همانطور که در شکل 02 نشان داده شده است ساخت.
شکل 02: توالی سانگر
توالی یابی سانگر یک تکنیک مهم است که در بسیاری از زمینه های زیست شناسی مولکولی کمک می کند. پروژه ژنوم انسانی با کمک روش های مبتنی بر توالی یابی سانگر با موفقیت به پایان رسید. توالی یابی سانگر همچنین در توالی یابی DNA هدف، تحقیقات سرطان و بیماری های ژنتیکی، تجزیه و تحلیل بیان ژن، شناسایی انسان، تشخیص پاتوژن، توالی یابی میکروبی و غیره مفید است.
توالی سانگر چندین معایب دارد:
- طول DNA در حال تعیین توالی نمی تواند بیشتر از 1000 جفت باز باشد
- فقط یک رشته را می توان در هر زمان توالی یابی کرد.
- این فرآیند زمان بر و گران است.
بنابراین، تکنیک های جدید توالی یابی پیشرفته با گذشت زمان برای غلبه بر این مشکلات توسعه یافتند. با این حال، توالی سنجی Sanger به دلیل نتایج بسیار دقیق آن تا حدود 850 قطعه طولی جفت پایه، هنوز در حال استفاده است.
Pyrosequencing چیست؟
Pyrosequencing یک تکنیک جدید توالی یابی DNA است که بر اساس "توالی یابی با سنتز" است. این تکنیک بر تشخیص انتشار پیروفسفات بر ادغام نوکلئوتید متکی است. این فرآیند توسط چهار آنزیم مختلف استفاده می شود: DNA پلیمرز، ATP سولفوریلاز، لوسیفراز و آپیراز و دو سوبسترا آدنوزین 5' فسفوسولفات (APS) و لوسیفرین.
فرآیند با اتصال پرایمر به الگوی DNA تک رشته ای و DNA پلیمراز شروع به ترکیب نوکلئوتیدهای مکمل آن می کند. هنگامی که نوکلئوتیدها به یکدیگر می پیوندند (پلیمریزاسیون اسید نوکلئیک)، گروه های پیروفسفات (دو گروه فسفات متصل به هم) و انرژی آزاد می کند.هر نوکلئوتید افزودن مقدار هم مولی پیروفسفات آزاد می کند. پیروفسفات توسط ATP سولفوریلاز در حضور سوبسترا APS به ATP تبدیل می شود. ATP تولید شده باعث تبدیل لوسیفراز با واسطه لوسیفراز به اکسی لوسیفرین می شود و نور مرئی را در مقادیر متناسب با مقدار ATP تولید می کند. نور توسط یک دستگاه تشخیص فوتون یا توسط فتو ضربی تشخیص داده می شود و یک پیروگرام ایجاد می کند. آپیراز ATP و dNTPهای غیر ترکیبی را در مخلوط واکنش تجزیه می کند. افزودن dNTP هر بار یکبار انجام می شود. از آنجایی که افزودن نوکلئوتید با توجه به ترکیب و تشخیص نور شناخته شده است، می توان توالی الگو را تعیین کرد. Pyrogram برای تولید توالی نوکلئوتیدی DNA نمونه همانطور که در شکل 03 نشان داده شده است استفاده می شود.
Pyrosequencing در آنالیز پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی و تعیین توالی بخشهای کوتاه DNA بسیار مهم است. دقت بالا، انعطاف پذیری، سهولت اتوماسیون و پردازش موازی از مزایای پیروزه یابی نسبت به تکنیک های توالی سنگر است.
شکل 03: Pyrosequencing
تفاوت بین Sanger Sequencing و Pyrosequencing چیست؟
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| توالی یابی سانگر یک روش توالی یابی DNA است که بر اساس ترکیب انتخابی ddNTPs با DNA پلیمراز و خاتمه زنجیره است. | Pyrosequencing یک روش توالی یابی DNA است که بر اساس تشخیص آزاد شدن پیروفسفات بر اثر ادغام نوکلئوتید است. |
| استفاده از ddNTP | |
| ddNTPs برای پایان دادن به همانندسازی DNA استفاده می شود | ddNTP استفاده نمی شود. |
| آنزیم‌های درگیر | |
| DNA پلیمراز استفاده می شود. | چهار آنزیم استفاده می شود: DNA پلیمراز، ATP سولفوریلاز، لوسیفراز و آپیراز. |
| زیرهای استفاده شده | |
| APS و لوسیفرین استفاده نمی شوند. | آدنوزین 5' فسفوسولفات (APS) و لوسیفرین استفاده می شود. |
| حداکثر دما | |
| این یک روند کند است. | این یک فرآیند سریع است. |
خلاصه - Sanger Sequencing در مقابل Pyrosequencing
توالی یابی سنگر و پیروسکه یابی دو روش توالی یابی DNA هستند که در زیست شناسی مولکولی استفاده می شوند. توالی یابی سانگر با پایان دادن به طول زنجیره، ترتیب نوکلئوتیدها را به ترتیب ترتیب می دهد در حالی که پیروزه یابی ترتیب دقیق نوکلئوتیدها را به ترتیب با ترکیب نوکلئوتیدها و تشخیص انتشار پیروفسفات ها ایجاد می کند.بنابراین، تفاوت اصلی بین توالی یابی سانگر و پیروسوالنینگ در این است که توالی سنجی سانگر روی توالی یابی با خاتمه زنجیره ای کار می کند در حالی که پیروسکئنینگ روی توالی یابی با سنتز کار می کند.
