تفاوت بین کلونینگ ژن و PCR

2024 نویسنده: Alex Aldridge | [email protected]. آخرین اصلاح شده: 2023-12-17 13:37

تفاوت کلیدی - شبیه سازی ژن در مقابل PCR

سنتز بسیاری از نسخه های DNA از یک قطعه DNA خاص، تقویت DNA نامیده می شود. دو فرآیند اصلی تکثیر DNA یعنی شبیه سازی ژن و PCR وجود دارد. تفاوت اصلی بین شبیه‌سازی ژن و PCR در این است که شبیه‌سازی ژن با ساختن یک DNA نوترکیب و رشد در داخل یک باکتری میزبان، نسخه‌های متعددی از یک ژن خاص را در داخل بدن تولید می‌کند، در حالی که PCR میلیون‌ها نسخه از یک قطعه DNA خاص را در شرایط آزمایشگاهی تولید می‌کند. دناتوراسیون و سنتز.

کلونینگ ژن چیست؟

شبیه‌سازی ژن تکنیکی است که برای مکان‌یابی و تکثیر یک ژن خاص از DNA ژنومی استخراج‌شده یک موجود زنده از طریق ساخت DNA نوترکیب استفاده می‌شود. DNA ژنومی حاوی هزاران ژن مختلف است که برای پروتئین ها کدگذاری شده اند. هنگامی که DNA استخراج می شود، شامل تمام ژن های ممکنی است که می تواند تحمل کند. تکنیک شبیه سازی ژن، تشخیص یک ژن خاص از DNA کل را امکان پذیر کرده است. بنابراین شبیه سازی ژن به عنوان یک ابزار مهم در زیست شناسی مولکولی عمل می کند.

ساخت کتابخانه ژنومی یک ارگانیسم در شبیه سازی ژن ضروری است اگر سرنخی در مورد مکان ژن مربوطه در DNA وجود نداشته باشد. یک کتابخانه ژنومی با استفاده از مراحل زیر ساخته شده است.

مرحله 1: استخراج DNA کل از ارگانیسمی که حاوی ژن مورد نظر است.

مرحله 2: محدود کردن هضم DNA استخراج شده برای تولید قطعات کوچک قابل کنترل. این مرحله توسط اندونوکلئازهای محدود کننده تسهیل می شود.

مرحله 3: انتخاب یک ناقل مناسب و باز کردن DNA ناقل با استفاده از همان اندونوکلئازهای محدودکننده. پلاسمیدهای باکتریایی معمولاً به عنوان ناقل برای حمل DNA خارجی استفاده می شوند. پلاسمیدها دایره های کوچکی از DNA هستند که در داخل باکتری ها قرار دارند.

مرحله 4: ترکیب DNA ناقل و DNA قطعه قطعه شده برای تولید مولکول DNA نوترکیب. این مرحله توسط DNA لیگاز کنترل می شود.

مرحله 5: انتقال مولکولهای DNA نوترکیب به باکتری میزبان. این مرحله به عنوان تبدیل شناخته می شود و با استفاده از شوک حرارتی انجام می شود.

مرحله 5: غربالگری سلول های باکتریایی تبدیل شده در محیط کشت. یک جمعیت ترکیبی از سلول های میزبان تبدیل شده و غیر تبدیل شده در پایان فرآیند تبدیل به دست می آید. به عنوان ژن مورد نظر فقط در سلول های میزبان تبدیل شده است. از این رو، انتخاب سلول های تبدیل شده ضروری است. انتخاب با استفاده از محیط های انتخابی حاوی آنتی بیوتیک انجام می شود. فقط سلول های تبدیل شده روی این محیط غربالگری رشد می کنند که امکان انتخاب را فراهم می کند.

مرحله 6: رشد باکتری برای تولید یک کتابخانه ژن. در این مرحله، سلول های میزبان تبدیل شده به محیط کشت تازه وارد می شوند که نیازهای رشد بهینه را فراهم می کند. مجموع کلنی های روی صفحات کشت نشان دهنده کتابخانه ژنومی آن ارگانیسم است.

مرحله 7: مولکول DNA نوترکیب حاوی ژن مورد نظر باید از هزاران قطعه کلون شده DNA نوترکیب غربالگری شود. می توان با استفاده از پروب هایی که ژن خاص را مشخص می کنند یا پروتئین خاصی از آن ژن حاصل می شود.

هنگامی که ژن علاقه مند حاوی کلنی باکتری از کل کلنی ها شناسایی شد، می توان میلیون ها نسخه از پلاسمید نوترکیب حاوی ژن ایجاد کرد.

شبیه‌سازی ژن در ایجاد کتابخانه‌های ژنی، تولید پروتئین خاص، ویتامین‌ها، آنتی‌بیوتیک‌ها، هورمون‌ها، توالی‌یابی و نقشه‌برداری ژنوم ارگانیسم‌ها، ساختن کپی‌های متعدد از DNA افراد در پزشکی قانونی و غیره استفاده می‌شود.

شکل_1: شبیه سازی ژن

PCR چیست؟

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) تکنیکی است که تعداد زیادی کپی از یک قطعه DNA خاص تولید می کند. تکثیر نمایی یک توالی DNA خاص توسط PCR در شرایط آزمایشگاهی بدست می آید. این تکنیک یک ابزار بسیار قدرتمند در زیست شناسی مولکولی است زیرا می تواند نمونه کوچکی از DNA را به مقدار قابل استفاده ضرب کند. PCR توسط Kary Mullis در سال 1983 معرفی شد و این اختراع برنده جایزه پیشرفت بزرگی در زیست شناسی مولکولی ایجاد کرد.

تکنیک

PCR از واکنش‌های مکرر PCR که در شکل 02 نشان داده شده است، پیروی می‌کند. یک واکنش PCR شامل سه مرحله اصلی است که در سه دمای مختلف رخ می‌دهد. دناتوره کردن دو رشته در DNA در 94 ⁰C، بازپخت پرایمرها در 68 ⁰C و طویل شدن رشته در 72 ⁰ C. بنابراین، زمانی که PCR انجام می شود، نوسان دما باید به شدت حفظ شود تا همانندسازی مناسب باشد. PCR در دستگاه PCR داخل لوله های PCR انجام می شود. لوله های PCR با مخلوط های PCR صحیح حاوی DNA الگو، Taq پلیمراز، پرایمرها، dNTPs و بافر بارگذاری می شوند.دناتوره کردن DNA نمونه دو رشته ای به DNA تک رشته ای با شکستن پیوندهای هیدروژنی بین بازهای مکمل در دمای 94-98 ^{0C انجام می شود. سپس تک رشته های DNA الگو برای آغازگرها در معرض دید قرار می گیرند. یک جفت پرایمر (جلو و معکوس) باید تهیه شود و برای تحمل دماهای بالا مقاوم در برابر حرارت باشند. پرایمرها توالی های DNA کوتاه تک رشته ای هستند که مکمل انتهای قطعه DNA هدف هستند. در PCR از پرایمرهای مصنوعی استفاده می شود. پرایمرها با پایه های مکمل DNA نمونه متصل می شوند و سنتز یک رشته جدید را آغاز می کنند. این مرحله توسط آنزیمی به نام Taq polymerase کاتالیز می شود. یک آنزیم DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت جدا شده از Thermus auqaticus. هنگامی که پرایمرها و نوکلئوتیدها (بلوک های سازنده) در دسترس هستند، Taq polymerase رشته جدیدی از DNA مکمل DNA الگو را می سازد. در پایان برنامه PCR، قطعه DNA تکثیر شده با استفاده از الکتروفورز ژل مشاهده می شود. در صورت نیاز به تجزیه و تحلیل بیشتر، محصول PCR از ژل خالص می شود.}

PCR برای تشخیص و پایش بیماری های ژنتیکی و اکتسابی، شناسایی مجرمان (در زمینه پزشکی قانونی)، مطالعه ساختار و عملکرد بخش هدفمند DNA، تعیین توالی و نقشه برداری از ژنوم موجودات، بسیار مفید است. و غیره. PCR به یک روش معمول آزمایشگاهی در آزمایشگاه های تحقیقاتی زیست شناسی پزشکی و مولکولی در میان دانشمندان تبدیل شده است زیرا کاربردهای بسیار متنوعی دارد.

شکل_2: واکنش زنجیره ای پلیمراز

تفاوت بین ژن کلونینگ و PCR چیست؟

کلونینگ ژن در مقابل PCR
شبیه‌سازی ژن، فرآیند ساخت چندین نسخه از یک ژن خاص در داخل بدن از طریق DNA نوترکیب و تبدیل به یک باکتری میزبان است.	تکنیک PCR کپی های متعددی از یک توالی DNA خاص را در شرایط آزمایشگاهی از طریق چرخه های مکرر واکنش های PCR تولید می کند.
نیاز به ساخت DNA نوترکیب
DNA نوترکیب به منظور تعیین مکان ژن تولید می شود.	DNA نوترکیب تولید نمی شود.
نیاز به کار
این فرآیند کار فشرده است.	نیاز به زایمان فشرده نیست.
فرآیند In vivo یا In vitro
ساخت DNA نوترکیب در شرایط آزمایشگاهی و تکثیر DNA در داخل بدن است.	تکثیر DNA به طور کامل در شرایط آزمایشگاهی اتفاق می افتد.

خلاصه - شبیه سازی ژن در مقابل PCR

کلونینگ ژن و PCR دو روشی هستند که برای تکثیر DNA استفاده می شوند. PCR یک فرآیند آزمایشگاهی است که چندین نسخه از DNA یک قطعه DNA خاص را بدون استفاده از DNA نوترکیب و ارگانیسم میزبان ایجاد می کند. شبیه سازی ژن در درجه اول یک فرآیند in vivo است که از طریق ساخت DNA نوترکیب منجر به ایجاد کپی های متعدد از یک ژن علاقه مند در داخل ارگانیسم میزبان می شود. این تفاوت بین شبیه سازی ژن و PCR است.